Σύνδεση
Εσωτερική πλατφόρμα του εργαστηρίου. Η πρόσβαση γίνεται μόνο με πρόσκληση.
Επισκόπηση
Δείγματα, πειράματα και απόθεμα του εργαστηρίου σε ένα σημείο. Τα δεδομένα τα βλέπουν μόνο τα μέλη της ομάδας.
Τελευταία πειράματα
Για παραγγελία
Αντίγραφα σε Excel
Κατέβασε όλα τα δεδομένα σε αρχεία CSV που ανοίγουν στο Excel. Κράτα αντίγραφο τακτικά.
Μέλη ομάδας
Στείλε πρώτα πρόσκληση από το Supabase (Authentication → Users → Invite user) και μετά πρόσθεσε το email εδώ.
Πρωτόκολλα
Τα πλήρη πρωτόκολλα είναι στα έγγραφα. Εδώ είναι οι πίνακες που χρειάζεσαι στον πάγκο.
Απομόνωση και χαρακτηρισμός EVs
Χωρίς υπερφυγοκέντρηση: οξίνιση, 0.22 µm, TFF → SEC ή Norgen, βακτηριακά EVs, Exoid, Micro BCA, σημεία παύσης.
Άνοιγμα πρωτοκόλλου →SDS-PAGE και Western blot
Συνταγές διαλυμάτων, πηκτές 10–12%, αναγωγικές και μη αναγωγικές συνθήκες, μεταφορά, αντισώματα, αντιμετώπιση προβλημάτων.
Άνοιγμα πρωτοκόλλου →Φυγοκεντρήσεις · SL 8R + TX-150
| Βήμα | g | Χρόνος | °C | Πότε |
|---|---|---|---|---|
| Κύτταρα | 300–500 × g | 10 min | 4 (RT φρέσκο μητρικό) | Όχι στη σκόνη |
| Ξεβούτυρωμα | 3,000 × g | 2 × 15 min | 4 | Όλα |
| Καζεΐνη (μετά pH 4.6) | max TX-150 | 30–45 min | RT | Όλα |
| 2η καθίζηση (αντί 0.45 µm) | max TX-150 | 30 min | 4 | Όλα |
| Amicon 3K | 3,000–4,000 × g | κύκλοι 10–15 min | 4 | Μετά το SEC, ως 100–200 µl |
Max TX-150: 5,000 rpm στην ετικέτα (Thermo: 4,500 rpm / 3,260 × g). Χαμηλό φρένο, κάδοι ζυγισμένοι, ποτέ Start με 30000.
Ροή απομόνωσης
- Ανασύσταση σκόνης σε PBS 25–37°C (όχι 70°C)
- Ξεβούτυρωμα 2 × 3,000 × g
- Οξικό 10% στάγδην ως pH 4.6, 37°C 5–10 min
- Φυγοκέντρηση καζεΐνης → pH 7.0–7.4 με NaOH 1 M αμέσως
- 2η καθίζηση → strainer 100 µm → αραίωση 1:1 → Millex-GV 0.22 µm
- Α: TFF → PURE-EVs · Β: Norgen Midi
- Aliquots → Exoid φρέσκο, τα υπόλοιπα −80°C
Σημεία παύσης
- Ναι: αποβουτυρωμένο γάλα (4°C έως αύριο)
- Ναι, ιδανικό: φιλτραρισμένο whey (4°C ≤ 24 h)
- Ναι: κλάσματα EVs σε aliquots (−80°C)
- Όχι: στην οξίνιση, στη μέση του SEC, στο Amicon
Western · δείκτες
| Δείκτης | Ρόλος | kDa | Συνθήκες |
|---|---|---|---|
| CD9 / CD81 | Διαμεμβρανικός | ~22–26 | Μη αναγωγικές |
| CD63 | Διαμεμβρανικός | ~30–60 | Μη αναγωγικές |
| TSG101 | Κυτταροπλασματικός | ~44–46 | Αναγωγικές |
| ALIX | Κυτταροπλασματικός | ~95 | Αναγωγικές |
| MFG-E8 | Γάλα | ~45–55 | Αναγωγικές |
| Calnexin | Αρνητικός | ~90 | Αναγωγικές |
| αs1-καζεΐνη / β-λακτοσφαιρίνη | Μόλυνση | ~23–25 / ~18 | Αναγωγικές |
Πηκτές · 2 mini, 1.0 mm
| 12% (10 ml) | Stacking 4% (5 ml) | |
|---|---|---|
| ddH₂O | 3.3 ml | 3.0 ml |
| 30% acryl/bis | 4.0 ml | 0.67 ml |
| Tris 1.5 M pH 8.8 | 2.5 ml | — |
| Tris 0.5 M pH 6.8 | — | 1.25 ml |
| SDS 10% | 100 µl | 50 µl |
| APS 10% | 100 µl | 50 µl |
| TEMED | 10 µl | 5 µl |
Buffers 10x · ανά 1 L
| Buffer | Σύσταση |
|---|---|
| Running | 30.3 g Tris + 144 g γλυκίνη + 10 g SDS |
| Transfer | 30.3 g Tris + 144 g γλυκίνη · 1x με 20% μεθανόλη |
| TBS | 24.2 g Tris + 80 g NaCl, pH 7.6 · TBS-T + 0.1% Tween-20 |
| Blocking | 5% BSA σε TBS-T (όχι γάλα) |
Δείγματα
Μητρώο δειγμάτων γάλακτος και των παραγώγων τους. Για ανθρώπινα δείγματα γράφεις μόνο κωδικό δότριας, ποτέ ονοματεπώνυμο ή στοιχεία επικοινωνίας.
Πειράματα
Ημερολόγιο απομονώσεων και μετρήσεων. Ο δείκτης καθαρότητας υπολογίζεται από σωματίδια/ml και µg/ml (Webber & Clayton, 2013).
Απόθεμα
Εξοπλισμός, κιτ, αναλώσιμα, αντιδραστήρια και αντισώματα.